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產(chǎn)品細(xì)節(jié)圖:
FastPure Cytoplasmic & Nuclear RNA purification Kit HandBook
FastPure 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 RNA 小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)
產(chǎn)品組成
產(chǎn)品介紹
本試劑盒可以快速地從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中提取細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核 RNA，不含酚氯仿等有毒試劑。
其提取的總 RNA 純度高，無(wú)蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)污染，可用于 RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA 差異
顯示、分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品級(jí)化妝品等用
途。
存儲(chǔ)條件
Buffer RN 置于 2-8℃保存；Buffer RT 可室溫（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入 β-巰基乙醇（或
DTT）的 Buffer RT 可室溫放置一個(gè)月；其他試劑室溫干燥保存可至少穩(wěn)定 12 個(gè)月。
需要額外準(zhǔn)備的材料
? 14.3 M β-巰基乙醇(β-ME) (常規(guī)購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化商品即為 14.3 M)或 2M DTT
? 70%乙醇：RNase-Free 水配制
? 無(wú)水乙醇（96%-100%）
? 無(wú)酶 1.5ml 離心管
? 無(wú)酶吸頭
? 干凈的手套
? 高速離心機(jī)
? 物理研磨設(shè)備
開(kāi)始前注意事項(xiàng) 請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)。
? 操作前在 Buffer RT 中加入 β-巰基乙醇（
β-ME）至終濃度為 1%（建議現(xiàn)配現(xiàn)用），如 1 ml Buffer RT
中加入 10μl β-巰基乙醇(或加入 20 μl 的 2 M DTT)。配好的 Buffer RT 可在 4℃維持穩(wěn)定一個(gè)月。
? Buffer RT 在儲(chǔ)存時(shí)可能會(huì)形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請(qǐng) 37℃加熱溶解后室溫使用。
? Buffer RW1 作為濃縮液提供，在第一次使用前加入 0.25 倍體積的乙醇（96-100％）以獲得工作溶液。
? Buffer RPE 作為濃縮液提供，在第一次使用前加入 4 倍體積的乙醇（96-100％）以獲得工作溶液。
? 如果執(zhí)行可選的柱上 DNA 酶消化步驟，請(qǐng)制備 DNase I 儲(chǔ)備液：將 DNase I 干粉（1500 U）溶解在
550μl RNase-Free ddH2O 中，輕柔混勻（禁止渦旋），分裝后-20℃貯存（可保存 9 個(gè)月）。
? RNase-free 水中不含任何抑菌因子，室溫放置或操作時(shí)可能會(huì)引入細(xì)菌或真菌污染，使用時(shí)盡量注意，
推薦開(kāi)瓶后分裝保存以減少污染風(fēng)險(xiǎn)保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。
? RNA 在 Buffer RT 中時(shí)不會(huì)被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含 RNase 的離心管或玻
璃器皿。
? RNA 提取操作及離心過(guò)程常溫進(jìn)行即可。
操作步驟：
1.請(qǐng)根據(jù)樣品種類(lèi)進(jìn)行以下步驟（1a 為動(dòng)物細(xì)胞，1b 為動(dòng)物組織）
1a. 收集動(dòng)物細(xì)胞： 懸浮細(xì)胞可直接 300×g 離心 5min 并仔細(xì)吸除上清留沉淀待使用；
單層貼壁細(xì)胞可通過(guò)直接裂解法（吸盡培養(yǎng)基留下貼壁細(xì)胞，待步驟 2 用 Buffer RT
裂解）或胰酶處理法（吸盡培養(yǎng)基留下貼壁細(xì)胞，用 PBS 清洗細(xì)胞，吸除 PBS 后
使用含 0.10%-0.25%胰酶的 PBS 使細(xì)胞脫落，加入含有血清的培養(yǎng)基使胰酶失活后
轉(zhuǎn)入無(wú)酶 1.5ml 離心管中 300×g 離心 5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集細(xì)胞數(shù)量不要超過(guò) 1×107，收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)基去除干凈，否則會(huì)導(dǎo)致步驟 2 時(shí)細(xì)胞裂解
不完全，影響 RNA 與吸附柱的結(jié)合，RNA 的產(chǎn)量降低。
1b. 動(dòng)物組織勻漿處理： 將 10mg-30mg 動(dòng)物組織轉(zhuǎn)移入無(wú)酶 1.5ml 離心管中并加入
600μl Buffer RT（動(dòng)物組織量不要超過(guò) 30mg）使用前請(qǐng)檢查 Buffer RT 是否加入 β-
巰基乙醇，使用研磨杵或電動(dòng)研磨機(jī)將動(dòng)物組織徹底研磨勻漿。直接進(jìn)行步驟 3.
2.加入 4℃預(yù)冷的 180μl Buffer RN 至細(xì)胞沉淀中，并于冰上孵育 5min。對(duì)于未消
化收集的培養(yǎng)在 3.5cm 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，可吸凈培養(yǎng)基用 PBS 清洗一次后，直接
加入 4℃預(yù)冷的 180μl Buffer RN 至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，然后用細(xì)胞刮刀輕輕刮動(dòng)并轉(zhuǎn)
移至無(wú)酶 1.5ml 離心管中，并于冰上孵育 5min。
對(duì)于提前離心沉淀在離心管中的細(xì)胞，通過(guò)輕彈離心管以使細(xì)胞沉淀徹底分散開(kāi)。懸浮液應(yīng)迅速澄清，表明質(zhì)膜
立即溶解。注意：細(xì)胞沉淀的不完全分散可能導(dǎo)致裂解效率低下和 RNA 產(chǎn)量降低。
3.將上述裂解物在 4oC 下以 300×g 離心 2min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的無(wú)酶 1.5ml 離心
管中用于細(xì)胞質(zhì) RNA 提取，沉淀用于細(xì)胞核 RNA 提取。如果在此過(guò)程的后續(xù)步
驟中使用相同的離心機(jī)，則保持離心室溫狀態(tài)。
上清液含有細(xì)胞質(zhì)提取物。根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的不同，它通常略帶混濁和黃白色。沉淀含有細(xì)胞核，上清中為細(xì)胞質(zhì)裂解物。
4.于步驟 3 種所得細(xì)胞質(zhì)裂解物及細(xì)胞沉淀管中分別加入 600 μl Buffer RT（使用前
請(qǐng)檢查 Buffer RT 是否加入 β-巰基乙醇或 DTT），充分渦旋混勻。
若沉淀物較多，可室溫裂解 3-5min，期間搖勻 2-3 次
5.將 430μl 無(wú)水乙醇（96–100％）分別加入兩管裂解物中，并用移液器將其充分混
合。 不要離心。
注意：從某些細(xì)胞系純化 RNA 時(shí)，加入乙醇后可能會(huì)出現(xiàn)沉淀。 這不會(huì)影響后續(xù)提取過(guò)程。
6.將步驟 5 混勻后的兩管溶液轉(zhuǎn)移入無(wú)酶吸附柱中并套上 2ml 收集管，≥8000×g
（≥10,000rpm）離心 1min，棄廢液，直至將溶液全部轉(zhuǎn)移完成吸附。
吸附柱最大上柱量為 700μl，若溶液過(guò)多可分多次上柱。后續(xù)操作若無(wú)特殊說(shuō)明吸附柱均置于 2ml 收集管中。
7.（可選步驟） 向吸附柱中央加入 80μl DNase Ⅰ 工作液，室溫（15℃-25℃）靜置
15min。配制 DNase Ⅰ 工作液： 取 10μl DNase Ⅰ儲(chǔ)備液入新的 RNase-Free 離心
管中，并加入 70μl Buffer RDD，輕柔混勻。
注意：DNase Ⅰ 對(duì)物理變性特別敏感，所以混勻時(shí)請(qǐng)上下倒置輕柔混勻，切勿渦旋。請(qǐng)確認(rèn) DNase Ⅰ 工作液加入
到正中央的柱膜上，否則 DNase 消化效果會(huì)不理想。
8.向兩個(gè)吸附柱中分別加入 700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm) 離心 30s，
棄廢液。
9.將兩個(gè)吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入 500μl Buffer RPE（使用前請(qǐng)
確認(rèn) Buffer RPE 按要求加入 4 倍體積無(wú)水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 離心
30s，棄廢液。
注意區(qū)分細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核 RNA 的吸附柱
10. 重復(fù)步驟 9 一次。
11. 倒棄濾液，將吸附柱放入收集管中, 以最大轉(zhuǎn)速(~13,400×g)離心 3min 干燥柱子。
12. 將兩個(gè)吸附柱分別套入新的 RNase-Free 的 1.5ml 離心管中，并置于無(wú) RNA 酶的
環(huán)境中開(kāi)蓋靜置 5-10min 至乙醇晾干。
若吸附柱中殘留乙醇將會(huì)對(duì)純化后的 RNA 的下游實(shí)驗(yàn)造成影響。
13. 向兩個(gè)吸附柱膜正中央分別加入 30-50μl RNase-Free Water，蓋上蓋子室溫靜置
3-5 min。后置于離心機(jī)中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 離心 3min 得到 RNA 溶液。
RNA 洗脫體積不應(yīng)少于 30μl，否則影響洗脫效率。洗脫后的 RNA 溶液應(yīng)置于-80℃儲(chǔ)存。
暫時(shí)沒(méi)有說(shuō)明書(shū)
1.《Multifunction Sr, Co and F co-doped microporous coating on titanium of antibacterial, angiogenic and osteogenic activities》
作者：Jianhong Zhou ,Lingzhou Zhao 影響因子：4.259
期刊：《Scientific Reports 6, Article number: 29069 (2016)》 PMID：27353337
作者：Jianhong Zhou ,Lingzhou Zhao 影響因子：4.259
期刊：《Scientific Reports 6, Article number: 29069 (2016)》 PMID：27353337
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