ECL Western Blotting Substrate

【保存條件】 

4℃避光保存 12 月 

【概述】

 超敏發光液用于檢測直接或間接標記辣根過氧化物酶 HRP 的抗體及其關聯的抗原。 用于 HRP 標記抗體的 Western Blot 和 HRP 標記探針的核酸雜交。由于采用了獨特的發光底物 系統，SuperStar ECL 超敏發光液是目前最靈敏的商業化熒光 ECL 檢測試劑（具有極高靈 敏度和高信噪比）；可在日光燈下進行發光操作；發光迅速，熒光可使 X 光膠片感光達 12 小時以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測；可使用更高的抗體稀釋倍數(1:2000～1:10000)， 極其節省抗體。

 【特點】 

? 飛克級靈敏度 - 在硝酸纖維素或 PVDF 膜上檢測低至飛克量的目標蛋白量 

? 高信號穩定性 - 孵育印跡在關鍵的 4 小時時間內提供穩定的信號持續時間，在最佳條 件下可產生長達 24 小時的光輸出 

? 穩定的試劑 - 8 小時工作溶液穩定性; 在 4℃下 1 年的試劑盒穩定性 

? 更經濟的抗體用量： 0.2 至 1.0μg/ mL 一抗（從 1 mg / mL 原液中 1：1000 至 1：5000 稀釋） 10 至 50 ng / mL 二級抗體（從 1 mg / mL 原液中 1：20,000 至 1：100,000 稀釋） 

【操作方法】 

1. 執行常規 SDS-PAGE、轉膜和 Western Blot 步驟。注意用 HRP 標記 lgG 或用一抗-鏈 親和素-生物素-HRP 夾法。

2. Western Blot 最后一次洗膜的同時新鮮配制發光工作液：分別取 A:B=1:1 混合（如需要 1ml 發光液則取 500ul ECL A 液和 500ul ECL B 液混合），放入干凈容器中混合。建議立即使用 工作液，室溫放置數小時后仍可使用但靈敏度略有降低。

 3. 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發光工作液 (0.125ml 發光工作液/cm2 膜)中，與發光工作液充分接觸。室溫孵育 2 分鐘，準備立即壓片 曝光。孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會導致曝光條帶異常。發光過程的本質是酶促 反應，使用過少的發光工作液不利反應進行，也會導致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。 為達節約目的可將 膜剪小但勿降低發光液用量。

 4. 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發光工作液。但勿洗去發光液。

 5. 打開 X 光膠片暗盒，在暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將 Western Blot 膜貼在 保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹 Western Blot 膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余 的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發光工作液。用膠帶將覆蓋 Western Blot 膜的保鮮膜固定在暗 盒內，蛋白帶面向上。

 6. 暗房內壓 X 光膠片，分別曝光不同的時間如數秒到數分鐘。顯影沖洗。

 【注意事項】 

1. 步驟 1～5 可在日光燈下操作;但發光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移 到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

2. 長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關系。曝光不足則條帶 模糊。

3. 發光工作液孵育約 2 分鐘后膜上的條帶發光。強條帶發光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋 白條帶 發光較弱甚至肉眼不可見但可使 X 光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發 光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續數小時并使 X 光膠片感光，因而弱帶可曝光 1-10 小 時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用 ECL 發光和 曝光。

4. 由于超敏發光液極其靈敏，強烈推薦大多數進口抗體起始濃度為一抗 1:1000～1:4000， 二抗 1:2000～1:5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。

5. 某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應選擇高質量保鮮膜。 

6. 使用肉眼可見的預染色蛋白 Marker 和熒光-放射自顯影曝光標簽可精確確定膠片上條帶 的位置和大小。

7. NaN3能抑制 HRP 活性，回收第二抗體應避免使用 NaN3，如必需使用勿超過 0.01%。